Kiefer Sutherland – Jack Bauer
Elisha Cuthbert – Kim Bauer
Carlos Bernard – Tony Almeida

Reiko Aylesworth – Michelle Dessler
James Badge Dale – Chase Edmunds
Jesse Borrego – Gael Ortega
Mary Lynn Rajskub – Chloe O’Brian
Zachary Quinto – Adam Kaufman
Paul Schulze – Ryan Chappelle
Randle Mell – Brad Hammond
Daniel Dae Kim – Tom Baker
Butch Klein – Darren Richards
Jenette Goldstein – Rae Plachecki
Carrie Kim – Jade Paik
David Herman – Dalton Furrelle
Bric Tenorio – Carl Adams
 Palmer, famiglia, staff e soci 

Dennis Haysbert – Presidente David Palmer
Penny Johnson Jerald – Sherry Palmer
Glenn Morshower – Aaron Pierce
D.B. Woodside – Wayne Palmer
Wendy Crewson – Anne Packard
Jamie McShane – Gerry Whitehorn
Albert Hall – Alan Milliken
Gina Torres – Julia Milliken
Alan Dale – Vice Presidente James Prescott
Conor O’Farrell – Ted Packard
Micheal Cavanaugh – Joseph O’Laughlin
 Famiglia Salazar e soci
Joaquim De Almeida – Ramon Salazar
Vincent Laresca – Hector Salazar
Vanessa Ferlito – Claudia Hernandez
Josh Cruz – Oriol
Julian Rodriguez – Sergio
Lorry Goldman – Douglas Shaye
Gino Montesinos – Eduardo
Eduardo Garcia – Emilio
Gonzalo Menendez – Pablo
 Famiglia Singer e soci
Riley Smith – Kyle Singer
Ted Marcoux – Sam Singer
Lucinda Jenney – Helen Singer
Agnes Bruckner – Linda
Kett Turton – Tim
Darin Cooper – Don
 Famiglia Saunders e soci
Paul Blackthorne – Stephen Saunders
Greg Ellis – Micheal Amador
Lothaire Bluteau – Marcus Alvers
Salvator Xuereb – Arthur Rabens
Alexandra Lydon – Jane Saunders
Joe D’Angerio – Osterlind
Gabrielle Fitzpatrick – Diana White
 Servizi Sanitari Nazionali 

Andrea Thompson – Dr. Nicole Duncan
Christina Chang – Dr. Sunny Macer
 Chandler Plaza Hotel (Staff e Ospiti)

Doug Savant – Craig Phillips
Paris Tanaka – Maya
Sue Jin Song – Annalie Kim
Scott Klace – Ospite arrabbiato (L’ospite che viene ucciso da Michelle)
 Personaggi vari 
Paul Vincent O’Connor – Hendrix (Capo della polizia)
Tony Todd – Detective Micheal Norris
Simon Templeman – Trevor Tomlinson (Agente della MI6)
Sarah Wynter – Kate Warner
Sarah Clarke – Nina Myers
Geoff Pierson – Senatore John Keeler
Mark Rolston – Bruce Foxton
Carlos Gomez – Luis Annicon
Kamala Lopez-Dawson – Theresa Ortega
JF Pryor – Zach Porter

 Il virus è nelle mani della famiglia Salazar, importanti trafficanti di droga messicani, che minaccia di diffonderlo in molte città statunitensi se non verrà rilasciato il capo-famiglia Ramon, da tre mesi in carcere per merito di Jack Bauer. I Salazar hanno un uomo che li informa sulle attività del CTU, di nome Gael, che ben presto si scopre essere un agente apparentemente corrotto del CTU. I rimanenti campioni di virus sembrano essere nelle mani di un corriere, un ragazzo di nome Kyle, alla ricerca di soldi facili, ma ben presto si scopre che così non è. Persa quella che sembrava l’unica traccia che conduceva al virus, sotto l’imminente minaccia di una epidemia globale, Jack, in una telefonata privata col Presidente Palmer, si propone per quella che potrebbe essere la sua ultima missione: fingersi un traditore e far evadere Ramon Salazar dal carcere per riconsegnarlo alla sua famiglia e arrestare così la diffusione del virus.

Andata a buon fine l’evasione Tony Almeida, capo del CTU, chiama il Presidente e lo aggiorna con notizie sorprendenti: tutto ciò avvenuto fino allora era solo una messinscena organizzata in gran segreto da Gael, Tony stesso e Jack per far credere ai Salazar che Jack fosse nuovamente dalla loro parte e creargli quindi una copertura per reinserire Jack tra i Salazar, affinché proponesse loro l’acquisto di un terribile virus sviluppato da scienziati dell’Est Europa, alla ricerca di un compratore, e, una volta che i Salazar ne fossero venuti in possesso, sequestrarlo per intero. Ramon sembra fidarsi di Jack e sembra intenzionato a concludere l’affare. Le cose si complicano quando Chase, di sua iniziativa e senza l’appoggio del CTU, si mette sulle tracce di Jack riuscendo a raggiungerlo nella residenza messicana dei Salazar. Jack, per mantenere la copertura, dovrà sparare al suo collega.

Nel frattempo si sviluppa parallelamente la vicenda del Presidente Palmer, il quale, dopo il licenziamento di Mike Novick, ha assunto come consigliere suo fratello Wayne, l’unica persona di cui si fidi. Palmer è impegnato nella campagna per la sua rielezione, lo sfidante è il senatore Keeler. Sorgono anche problemi con un suo storico sostenitore e finanziatore, il potente Alan Milliken, per risolvere i quali Palmer sarà costretto ad avvalersi nuovamente dell’aiuto della sua ex-moglie Sherry. Milliken sarà ben presto trovato morto e Palmer sospetterà un coinvolgimento di Sherry, trovandosi tuttavia costretto a coprirla di fronte alla polizia.

Jack e Ramon incontrano Michael Amador, venditore del virus, ma tra loro si frappone la storica nemica di Jack, Nina Myers, che ha un’offerta più alta di quella dei Salazar. Persa l’asta Jack propone ai Salazar di arrivare comunque al virus, convincendo Nina a rivenderglielo una volta impossessatosene. Quando Nina entra finalmente in possesso del virus, consegnatole da Amador al luogo di incontro prestabilito, Ramon e Nina cercano di fregare Jack fuggendo col virus, che tuttavia si rivelerà subito per quello che è veramente: una bomba che uccide Ramon. Nina cade nelle mani degli agenti del CTU, nel frattempo arrivati in Messico su segnalazione di Jack, mentre Amador, ancora in possesso del vero virus, riesce a fuggire. Nina, interrogata su un possibile vero acquirente del virus, non fornisce alcuna informazione utile, cerca anzi di ostacolare le indagini inserendo un virus nel sistema informatico del CTU e Jack si prende la sua vendetta per l’uccisione di sua moglie Teri, avvenuta alla fine del giorno 1.

Amador, nel frattempo direttosi a Los Angeles, incontra il vero acquirente del virus che minaccia subito di spargerne una fiala in un hotel. Michelle e Gael si dirigono all’hotel ma non riescono a impedire che il virus venga rilasciato. Tutti gli ospiti dell’albergo, compresi Michelle, Gael e altri agenti del CTU vengono messi in quarantena per la probabile contaminazione. Il compratore si rivela ben presto essere un certo Stephen Saunders, ex collega di Jack nella missione Drazen, che, sentitosi abbandonato dal governo statunitense dopo la missione Drazen, decide di vendicarsi sul suo Paese. Le richieste di Saunders, per evitare di rilasciare in diverse città statunitensi le altre 11 fiale di virus in suo possesso, sono estreme. Una di esse prevede l’uccisione di Ryan Chappelle, direttore divisionale del CTU. Toccherà a Jack il penoso compito. Jack e il CTU riescono tuttavia ad arrivare al covo di Saunders, grazie alle informazioni fornite da sua figlia.

Intanto il virus rilasciato all’hotel inizia a mietere le sue vittime, tra le quali c’è anche Gael. Michelle sembra invece essere immune ed esce dalla quarantena. Viene però catturata da Saunders. Tony Almeida, per salvare la vita della moglie, è costretto a soddisfare le richieste di Saunders, permettendone di fatto la fuga. Jack riesce a convincere Tony che la cosa migliore, per catturare Saunders e salvare la vita a Michelle, è proporgli uno scambio tra Michelle e la figlia di Saunders, custodita al CTU. Saunders viene catturato al luogo dello scambio di prigionieri e indotto a rivelare la posizione delle altre 11 fiale. Tutte vengono trovate e distrutte, tranne una, quella di Los Angeles, nelle mani di un corriere di nome Rabens sulle cui tracce si mettono Jack e Chase, nel frattempo liberatosi dalla famiglia Salazar e rientrato alla base. Per impedire la diffusione del virus Jack e il suo collega saranno costretti a un ultimo, doloroso sacrificio.

Nel frattempo Tony Almeida viene arrestato con l’accusa di tradimento e David Palmer, saputo della morte di Sherry, decide di ritirarsi dalla corsa alla Casa Bianca.